摘要：基于四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)構(gòu)建白蛋白(albumin,Alb)啟動子調(diào)控大鼠uPA(urokinase-type plasminogen activator,ruPA)轉(zhuǎn)基因肝特異性過表達的慢病毒載體pLVX-Alb-TetOne-TRE-ruPA-T2A-CopGFP(pLATTRUTG)。以CTG0875-2-11質(zhì)粒為模板,PCR擴增大鼠的uPA(ruPA)基因,3’端添加Flag標簽,In-Fusion克隆至pLVX-Alb-TetOne-TRE-T2A-CopGFP(pLATTTG)質(zhì)粒中,得到慢病毒載體pLVX-Alb-TetOne-TRE-ruPA-T2A-CopGFP(pLATTRUTG),所構(gòu)建質(zhì)粒經(jīng)測序和酶切鑒定。將pLATTRUTG瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞,轉(zhuǎn)染后24 h倒置熒光顯微鏡檢測CopGFP表達;接著向6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入強力霉素(Doxycycline,Dox),48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察CopGFP表達(包括未加Dox的孔),隨后收集細胞以提取總RNA和總蛋白,用于RT-qPCR檢測ruPA及報告基因表達和Western blot檢測標簽蛋白Flag表達。酶切和測序確證我們成功構(gòu)建了慢病毒載體pLATTRUTG;瞬轉(zhuǎn)293T細胞后,24 h倒置熒光顯微鏡下可見零星細胞(約占0.1%)發(fā)弱的綠色熒光,加Dox 48 h后所有細胞展現(xiàn)強的綠色熒光,而不加Dox的孔內(nèi)仍然只見到零星細胞(約占0.1%)發(fā)弱的綠色熒光。RT-qPCR和Western blot檢測結(jié)果顯示,與不加Dox的細胞相比,加Dox的細胞中ruPA、報告基因CopGFP和Flag表達水平顯著升高。結(jié)果提示,成功基于四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)構(gòu)建Alb啟動子調(diào)控大鼠uPA轉(zhuǎn)基因表達的慢病毒載體pLATTRUTG,為相關(guān)后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。