時(shí)間：2023-03-07 15:19:09
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戊肝疫苗研制
基因工程疫苗是用基因工程方法或分子克隆技術(shù)，分離出病原的保護(hù)性抗原基因，將其轉(zhuǎn)入原核或真核系統(tǒng)使表達(dá)出該病原的保護(hù)性抗原，制成疫苗，或者將病原的毒力相關(guān)基因刪除掉，使成為不帶毒力相關(guān)基因的基因缺失苗。包括多肽或亞單位疫苗、顆粒載體疫苗、病毒活載體疫苗、細(xì)菌活載體疫苗、基因重配疫苗以及基因缺失疫苗如乙肝疫苗等。
2012年1月11日——一個(gè)原本并不特殊的日子，卻因一份捷報(bào)而注定要被載入史冊(cè)。科技部在這一天宣布：由廈門(mén)大學(xué)和養(yǎng)生堂萬(wàn)泰公司聯(lián)合研制的“重組戊型肝炎疫苗（大腸埃希菌）”已獲得國(guó)家一類(lèi)新藥證書(shū)和生產(chǎn)文號(hào)，成為世界上第一個(gè)用于預(yù)防戊型肝炎的疫苗。
這是50年來(lái)，人類(lèi)在經(jīng)受了10余次萬(wàn)人以上的戊肝重大疫情后等來(lái)的一份捷報(bào)。
14年“磨”出世界第一
戊肝疫苗的成功研發(fā)，標(biāo)志著我國(guó)在生物制藥原始創(chuàng)新領(lǐng)域取得重大突破，它的面世讓中國(guó)在基因工程病毒疫苗的原始創(chuàng)新上實(shí)現(xiàn)了零的突破。11.3萬(wàn)人、30余萬(wàn)針次的研究顯示，該疫苗具有良好的安全性和保護(hù)性。
2月28日，疫苗研發(fā)團(tuán)隊(duì)的核心成員——廈門(mén)大學(xué)國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心主任夏寧邵教授，在接受科技日?qǐng)?bào)記者采訪時(shí)表示：“重組戊肝疫苗是迄今唯一使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研制的病毒疫苗。它的成功研制扭轉(zhuǎn)了國(guó)際醫(yī)藥界中‘原核系統(tǒng)不能用于病毒疫苗研制’的傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)。”
“傳統(tǒng)的疫苗研制方法主要有兩種途徑。一種是將病毒放在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行大量培養(yǎng)、滅活，再輔以佐劑，用這種方法制成的疫苗叫滅活疫苗；第二種是將病原體在體外反復(fù)傳代，去除其致病性，但保留其免疫原性，用這種方法制成的疫苗叫減毒活疫苗。而我們這次是采用的基因工程技術(shù)?！?夏寧邵告訴記者，“與傳統(tǒng)滅活疫苗和減毒活疫苗比較，基因工程疫苗的研發(fā)不依賴(lài)于病原體的培養(yǎng)，因此對(duì)于大量尚未建立成熟體外培養(yǎng)技術(shù)的病原體也能進(jìn)行疫苗的研制。在生產(chǎn)過(guò)程中，基因工程疫苗完全不涉及病原體，消除了由于病原體滅活不徹底或減毒不完全導(dǎo)致的安全性問(wèn)題。不僅如此，基因工程疫苗的研發(fā)還可通過(guò)精心設(shè)計(jì)的純化過(guò)程實(shí)現(xiàn)對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中伴隨的各類(lèi)雜質(zhì)的高效清除和殘余成分的高度可控，降低了由于雜質(zhì)導(dǎo)致的各類(lèi)接種副反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，提高了疫苗的安全性和耐受性，同時(shí)還能提高不同疫苗生產(chǎn)批次間的均一性。”
從1998年開(kāi)始，時(shí)任國(guó)家試劑與疫苗中心主任、廈門(mén)大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院院長(zhǎng)的夏寧邵便帶領(lǐng)著他的團(tuán)隊(duì)，著手進(jìn)行戊肝疫苗的研發(fā)。與所有的新藥研發(fā)一樣，重組戊肝疫苗的研發(fā)并非一路坦途。
歷經(jīng)14年艱苦研發(fā)，由廈門(mén)大學(xué)國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心和企業(yè)的200余名科研人員組成的課題組，在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域、應(yīng)用基礎(chǔ)研究領(lǐng)域和應(yīng)用研究領(lǐng)域，取得了保護(hù)性抗原識(shí)別及結(jié)構(gòu)表征、病毒顆粒組裝機(jī)制等多項(xiàng)發(fā)現(xiàn)成果，并突破了原核表達(dá)類(lèi)病毒顆粒、高效純化及體外自組裝等一系列關(guān)鍵技術(shù)障礙，創(chuàng)建出具有多項(xiàng)全球自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的核心技術(shù)體系。
夏寧邵告訴記者，該體系的關(guān)鍵技術(shù)已在14個(gè)主要國(guó)家申請(qǐng)了12項(xiàng)發(fā)明專(zhuān)利，對(duì)我國(guó)發(fā)展具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的創(chuàng)新疫苗并高起點(diǎn)地參與國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)具有深遠(yuǎn)意義。基于該體系關(guān)鍵技術(shù)，團(tuán)隊(duì)研制的另一個(gè)疫苗“人瘤病毒16/18型二價(jià)疫苗”（宮頸癌疫苗）已經(jīng)打破了美英技術(shù)封鎖成為全球第3個(gè)、國(guó)內(nèi)第1個(gè)獲準(zhǔn)進(jìn)行臨床試驗(yàn)的宮頸癌疫苗，目前已基本完成Ⅱ期臨床試驗(yàn)，初步結(jié)果顯示該疫苗安全并能刺激人體產(chǎn)生高滴度抗體。
夏寧邵說(shuō)：“戊肝疫苗是國(guó)家工程的成果，也是產(chǎn)學(xué)研協(xié)同創(chuàng)新的成果。”這份30微克的戊肝疫苗，不僅見(jiàn)證著研發(fā)人員的辛勞，同時(shí)也記錄著我國(guó)重大科技專(zhuān)項(xiàng)自主創(chuàng)新的步伐：自2005年起，國(guó)家863計(jì)劃開(kāi)始對(duì)戊肝疫苗項(xiàng)目進(jìn)行支持，有效地帶動(dòng)了地方、企業(yè)投入研發(fā)資金近5億元，其臨床研究也被列入“十一五”863計(jì)劃重大項(xiàng)目中，這為課題組在國(guó)內(nèi)外率先研制成功戊型肝炎疫苗提供了重要支撐。
談及疫苗研發(fā)的前景，夏寧邵顯得信心滿懷。他的信心來(lái)自于國(guó)家對(duì)這個(gè)產(chǎn)業(yè)的大力支持：2007年，國(guó)家將生物醫(yī)藥確定為“十二五”期間重點(diǎn)發(fā)展的戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)，尤其是用于應(yīng)對(duì)突發(fā)生物事件的疫苗及免疫佐劑等還被列入了公共安全領(lǐng)域生物安全保障方面的優(yōu)先發(fā)展主題。
現(xiàn)階段疫苗研發(fā)應(yīng)以集成創(chuàng)新為主
作為全國(guó)政協(xié)委員，中國(guó)食品藥品檢定研究院菌種室主任王國(guó)治一直關(guān)注著疫苗領(lǐng)域的發(fā)展。對(duì)夏寧邵團(tuán)隊(duì)所取得的成功，他難掩心中的喜悅和激動(dòng)：“我國(guó)能在世界上第一個(gè)研發(fā)出戊肝疫苗確實(shí)非常令人振奮！”
但就國(guó)內(nèi)疫苗研發(fā)的整體水平，王國(guó)治直言不諱：“我國(guó)在疫苗研發(fā)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究力量還比較薄弱，十個(gè)研發(fā)有九個(gè)都出不了結(jié)果。而國(guó)家又太過(guò)于強(qiáng)調(diào)疫苗研發(fā)的完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，這與我國(guó)目前的疫苗研發(fā)水平不相符合?！?/p>
“中國(guó)的疫苗研發(fā)，前期工作幾乎都是由大專(zhuān)院校的研究生在做，其可信度和創(chuàng)新性都不夠，后期工作也往往跟不上。多數(shù)人的研究都以仿制為主，盡管拿了專(zhuān)利，出了蛋白，但真正要作出成果卻很難，常常是實(shí)驗(yàn)完了，出來(lái)一大堆報(bào)廢產(chǎn)品?！蓖鯂?guó)治認(rèn)為，針對(duì)我國(guó)在疫苗領(lǐng)域現(xiàn)有的研發(fā)水平，“在引進(jìn)國(guó)外成熟技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行整合創(chuàng)新、集成創(chuàng)新才是這個(gè)階段的重點(diǎn)?！?/p>
王國(guó)治在考察了發(fā)達(dá)國(guó)家的疫苗生產(chǎn)企業(yè)后發(fā)現(xiàn)：在疫苗研發(fā)上，中國(guó)缺的不是硬件，也不是錢(qián)，缺的是技術(shù)和管理規(guī)范。中國(guó)對(duì)疫苗生產(chǎn)企業(yè)的硬件要求比國(guó)外更嚴(yán)格，可在軟件方面比如管理規(guī)范上卻放得比較寬。而事實(shí)上，疫苗生產(chǎn)過(guò)程中，后期主要是規(guī)范性管理的問(wèn)題。
在王國(guó)治看來(lái)，目前整個(gè)疫苗產(chǎn)業(yè)還缺少一種系統(tǒng)的協(xié)作。他認(rèn)為，“這與國(guó)家在疫苗研發(fā)領(lǐng)域和產(chǎn)業(yè)規(guī)劃上缺乏一種整體的頂層設(shè)計(jì)有關(guān)?！?/p>
王國(guó)治告訴記者，受多種因素制約，國(guó)家免疫規(guī)劃疫苗政府定價(jià)總體水平偏低，利潤(rùn)空間較小，以一支重組蛋白類(lèi)的乙肝疫苗為例，國(guó)家定價(jià)只有3塊多錢(qián)每人次，這在一定程度上影響了企業(yè)提高產(chǎn)品質(zhì)量和進(jìn)行產(chǎn)品升級(jí)換代的積極性。而第二類(lèi)疫苗為市場(chǎng)調(diào)節(jié)價(jià)格產(chǎn)品，流通環(huán)節(jié)較多，市場(chǎng)價(jià)格偏高。
“疫苗產(chǎn)業(yè)是關(guān)系國(guó)計(jì)民生的朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè)。”對(duì)此，王國(guó)治建議，國(guó)家在制定產(chǎn)業(yè)發(fā)展策略時(shí)，應(yīng)當(dāng)充分考慮產(chǎn)業(yè)自身的特點(diǎn)和不同的發(fā)展背景。在投入上，對(duì)與老百姓生命利益息息相關(guān)的和研發(fā)成本高、失敗風(fēng)險(xiǎn)大的一類(lèi)疫苗，以及共患病的疫苗，國(guó)家應(yīng)當(dāng)加大扶持力度，而對(duì)具有良好發(fā)展前景和自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的二類(lèi)疫苗，則應(yīng)當(dāng)以引導(dǎo)企業(yè)生產(chǎn)為主。
加大投入優(yōu)先發(fā)展疫苗產(chǎn)業(yè)
對(duì)疫苗產(chǎn)業(yè)的明天充滿同樣期待的，還有全球第一支甲流疫苗的生產(chǎn)企業(yè)——北京科興生物制品有限公司的總經(jīng)理尹衛(wèi)東。
在甲流肆虐的2009年，尹衛(wèi)東帶領(lǐng)著自己的員工在短短的87天中成功生產(chǎn)出全世界第一支甲流疫苗。在他看來(lái)，接種疫苗不但是保護(hù)自己的一種措施，同時(shí)也是保護(hù)他人的一種手段。
“然而目前，人們對(duì)接種疫苗的社會(huì)認(rèn)知度卻還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。”尹衛(wèi)東舉例說(shuō)，為了減少老年人群因流感并發(fā)癥帶來(lái)的死亡，北京市政府每年都為60歲以上的老人免費(fèi)接種流感疫苗，然而卻只有約50%的老年人進(jìn)行了自愿接種。
“如果能讓老年人接種流感疫苗的百分比從現(xiàn)在的50%提高到80%，老年人因老年病和流感造成的死亡率就會(huì)有所降低，這樣，實(shí)現(xiàn)‘十二五’期間將我國(guó)人均壽命提高1歲的目標(biāo)就會(huì)立竿見(jiàn)影?！币l(wèi)東說(shuō)，“但如果沒(méi)有疫苗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展就提供不了這樣的服務(wù)。疫苗產(chǎn)業(yè)不僅具有技術(shù)高附加值的特性，而且還能節(jié)省資源和能源，對(duì)整個(gè)經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展具有保駕護(hù)航的作用，應(yīng)該得到優(yōu)先發(fā)展?！?/p>
[關(guān)鍵詞]基因工程疫苗 核酸疫苗 免疫
[中圖分類(lèi)號(hào)]Q789-01 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1009-5349（2014）11-0081-01
自Edward Jenne醫(yī)生發(fā)明天花疫苗開(kāi)始，已有幾千種疫苗被開(kāi)發(fā)出來(lái)，疫苗逐漸成為人類(lèi)與疾病做斗爭(zhēng)的重要武器之一。傳統(tǒng)疫苗具有生產(chǎn)的成本高、疫苗中含強(qiáng)毒性致病物質(zhì)、減毒株突變及部分疾病用傳統(tǒng)的疫苗防治收效甚微等缺點(diǎn)。所以，研制更安全、更高效的疫苗十分必要。
DNA重組技術(shù)為新一代疫苗――基因工程疫苗的研制提供了全新的方法?；蚬こ桃呙缡侵笐?yīng)用DNA重組技術(shù)，通過(guò)基因組改造，降低病原微生物的致病性，提高免疫原性，進(jìn)而達(dá)到防治傳染病的目的。迄今為止，基因工程疫苗是最先進(jìn)的疫苗，相比傳統(tǒng)疫苗而言它有巨大的優(yōu)勢(shì)。
一、基因工程疫苗種類(lèi)
應(yīng)用基因工程技術(shù)開(kāi)發(fā)的已經(jīng)使用和正在研制的新型疫苗種類(lèi)主要有基因工程亞單位疫苗、基因工程活載體疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗、轉(zhuǎn)基因植物可食疫苗等。
（一）基因工程亞單位疫苗
該類(lèi)疫苗僅包含病原體的抗原，不包含病原體的其他遺傳信息?；蚬こ虂唵挝灰呙缤ㄟ^(guò)表達(dá)病毒的主要保護(hù)性抗原蛋白獲得免疫原性，具有安全、便于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。該類(lèi)疫苗的制備步驟如下：①了解編碼具有免疫原活性的抗原蛋白對(duì)應(yīng)的基因信息。②從大腸埃希氏菌、酵母、轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物等表達(dá)系統(tǒng)中選擇最適表達(dá)載體。如：酵母表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)大規(guī)模生產(chǎn)人用重組肝炎疫苗。基因工程亞單位疫苗可細(xì)分為：細(xì)菌性疾病、病毒性疾病和激素亞單位疫苗。
1.細(xì)菌性疾病亞單位疫苗
分離和鑒定致病菌主要免疫原和毒力因子是研究細(xì)菌性亞單位疫苗的基礎(chǔ)，目前已研制出與炭疽、大腸桿菌病、牛布魯氏菌病等對(duì)應(yīng)的亞單位疫苗，均能對(duì)相應(yīng)的疾病產(chǎn)生有效的保護(hù)作用。史百芬等發(fā)現(xiàn)RSVF蛋白亞單位疫苗（PFP-1）注射接種后接種者無(wú)呼吸道疾病加劇作用。
2.病毒性疾病亞單位疫苗
大多數(shù)病毒基因組已經(jīng)被克隆和完全測(cè)序，因此病毒性亞單位疫苗的研制相對(duì)簡(jiǎn)單?，F(xiàn)在病毒性疾病亞單位疫苗主要有口蹄疫、狂犬病、乙肝疫苗等。中國(guó)臺(tái)灣省科學(xué)家研制的禽流感亞單位疫苗效力遠(yuǎn)比滅活疫苗高。祁賢等應(yīng)用酵母系統(tǒng)表達(dá)生產(chǎn)雞傳染性腔上囊病病毒VP2亞單位疫苗，發(fā)現(xiàn)其可完全取代傳統(tǒng)滅活疫苗。
3.激素亞單位疫苗
該疫苗是以生長(zhǎng)抑制素為免疫原的一類(lèi)疫苗。杜念興等將大腸埃希氏菌中表達(dá)的生長(zhǎng)抑制素基因與HbsAg基因融合，通過(guò)Vero細(xì)胞表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫原性。杜念興等用SS基因疫苗免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)口服型SS基因疫苗免疫小鼠后可在小腸表達(dá)HBsAg/SS融合蛋白，推測(cè)該基因疫苗刺激機(jī)體表達(dá)蛋白后能產(chǎn)生SS抗體。
（二）基因工程活載體疫苗
此類(lèi)疫苗生產(chǎn)主要有兩種方法，一是使非致病性微生物表達(dá)某種特定病原物的抗原決定簇基因，進(jìn)而產(chǎn)生免疫原性，另一種是致病性微生物被修飾或去掉毒性基因，但仍保持免疫原性?；钶d體疫苗結(jié)合了活疫苗和死疫苗的共同優(yōu)點(diǎn)，在免疫力上具有很大的優(yōu)勢(shì)，分復(fù)制性和基因突變活載體疫苗。
（三）核酸疫苗
核酸疫苗接種后，抗原合成、增加與病原自然感染十分相似;還具有免疫原性單一;易構(gòu)建和制備，穩(wěn)定性好，成本低廉，適于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。
二、展望
疫苗開(kāi)發(fā)具有安全性、有效性、價(jià)廉性、易推廣性等特點(diǎn)?；蚬こ桃呙缇哂袀鹘y(tǒng)疫苗無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)，是疫苗產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的主要方向。研制多聯(lián)或多價(jià)疫苗是基因工程疫苗的主要發(fā)展方向。
【參考文獻(xiàn)】
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關(guān)鍵詞：植物疫苗；基因工程；表達(dá)系統(tǒng)；安全性
1 植物疫苗的免疫原理
植物疫苗可誘導(dǎo)粘膜免疫反應(yīng)，小腸淋巴組織的粘膜上有一種特殊的細(xì)胞叫做膜細(xì)胞（M 細(xì)胞）。粘膜免疫應(yīng)答就是由M 細(xì)胞識(shí)別抗原開(kāi)始的。M細(xì)胞識(shí)別抗原并將其傳遞給巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和其它抗原呈遞細(xì)胞，再將抗原展示給輔T細(xì)胞，輔T細(xì)胞識(shí)別外源蛋白質(zhì)片段后就會(huì)刺激B細(xì)胞制造和釋放能中和抗原的抗體，當(dāng)疾病因子出現(xiàn)時(shí)，記憶輔T細(xì)胞刺激胞毒T 細(xì)胞攻擊受感染的細(xì)胞，同時(shí)它迅速刺激記憶B 細(xì)胞分泌中和抗體消滅入侵的病原體。總的來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)基因植物疫苗可以誘導(dǎo)相應(yīng)的血清型的IgA 和IgG 反應(yīng)。
2 植物疫苗的特點(diǎn)
2.1 安全性高
植物是人類(lèi)食物來(lái)源之一，除個(gè)別人群對(duì)某些特定的植物過(guò)敏外，其安全性高。用動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)疫苗，可能有動(dòng)物病毒的污染，對(duì)人類(lèi)存在潛在危害。而植物病毒不會(huì)感染人類(lèi)，比較安全，同時(shí)也可避免微生物生產(chǎn)疫苗帶來(lái)的有害產(chǎn)物。
2.2 成本低
植物種植系統(tǒng)簡(jiǎn)單易行，植物細(xì)胞培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，便于進(jìn)行遺傳操作，可通過(guò)大面積栽培獲得廉價(jià)的疫苗，且不需要技術(shù)、設(shè)備和種植條件等巨大投資。農(nóng)作物可以當(dāng)?shù)厣a(chǎn)，還易于儲(chǔ)藏和運(yùn)輸，而且經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期種植，植物栽培、收獲、貯藏、加工程序已經(jīng)形成工業(yè)化。與植物生物反應(yīng)器相比，原核生物反應(yīng)器與動(dòng)物生物反應(yīng)器生產(chǎn)時(shí)需要昂貴的技術(shù)設(shè)備、大量的人力物力。
2.3 植物具有完整的真核表達(dá)系統(tǒng)
具有與動(dòng)物相同的真核加工修飾系統(tǒng)?？梢詫?duì)重組蛋白進(jìn)行糖基化、磷酸化、酰胺化、亞基正確裝配等。微生物系統(tǒng)不能對(duì)真核生物蛋白進(jìn)行正確的翻譯后加工。
2.4 轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因可重組
通過(guò)植物雜交的方法進(jìn)行基因重組，進(jìn)而在植物體內(nèi)積累多種病原體的抗原基因，生產(chǎn)出方便高效的多聯(lián)疫苗。
3 植物基因工程疫苗外源基因的表達(dá)系統(tǒng)
3.1 瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)
主要采用植物病毒作為載體，而外源基因插入到病毒基因組中，通過(guò)病毒感染植株，從而將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞內(nèi)，采用這種轉(zhuǎn)化方式，外源基因并不整合至植物基因組中，只是利用寄主細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行復(fù)制，以高拷貝的形式游離于植物中，并進(jìn)行高效的表達(dá)，因此可在短時(shí)間內(nèi)在植物細(xì)胞內(nèi)積累大量的外源蛋白。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，外源基因蛋白的產(chǎn)量一般要低于細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白總量的1%；而采用這種瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),外源基因蛋白總量會(huì)遠(yuǎn)大于1%。
3.2 穩(wěn)定整合系統(tǒng)
3.2.1 土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。目前根癌農(nóng)桿菌主要用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化植物的機(jī)制已從分子水平上基本得到解釋。而發(fā)根農(nóng)桿菌，由于對(duì)Ri 質(zhì)粒了解得還不充分，所以對(duì)這種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的研究主要集中在以生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物為目的的根組織培養(yǎng)和根的發(fā)育。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化最常采用共培養(yǎng)法，即使用農(nóng)桿菌菌液與葉盤(pán)、愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、莖段、下胚軸段、子葉切片等部分進(jìn)行共培養(yǎng)，從而達(dá)到轉(zhuǎn)化的目的。
3.2.2 外源DNA 直接導(dǎo)入法。主要包括基因槍法、電激發(fā)、PEG誘導(dǎo)法、激光穿孔法、脂質(zhì)體法、超聲波法，其中最常用的是基因槍法。它是將帶有外源基因的質(zhì)粒用亞精胺包裹為直徑1μm 左右的金彈或鎢彈，再用高壓氦氣、火藥爆炸力、高壓放電氣體作為動(dòng)力加速子彈，使它們穿過(guò)植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，將外源基因帶入具有再生能力的植物組織，這樣可以在很大程度上縮短再生的時(shí)間，從而避免體細(xì)胞變異的發(fā)生。
4 以植物為載體的免疫技術(shù)
4.1 植物疫苗免疫原性和免疫保護(hù)作用
由于植物疫苗一般是通過(guò)食用來(lái)被人體利用。所以如何避免消化酶的影響來(lái)保護(hù)抗原就是一個(gè)重要的研究課題。目前，避免消化酶的影響來(lái)保護(hù)抗原可分為2類(lèi)方法：①用沙門(mén)氏菌和弧狀霍亂桿菌作為載體；②用保護(hù)性的包被對(duì)抗原進(jìn)行包裝。
用減毒的菌株可以把抗原引向粘膜的表面，有利于粘膜免疫系統(tǒng)攝取所表達(dá)的抗原。但是基于減毒菌株的方法具有潛在安全缺陷，而后者可通過(guò)生物降解的多聚物、脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)體或者表達(dá)抗原的轉(zhuǎn)基因植物來(lái)實(shí)現(xiàn)。許多研究表明，植物材料可潛在地保護(hù)所選定的抗原。特別在種子中，植物可為亞單位疫苗提供一個(gè)富含蛋白酶抑制物的糖類(lèi)聚合物基質(zhì)環(huán)境。其它的抗原包裝方法需要煩瑣的處理步驟；而通過(guò)植物種子來(lái)進(jìn)行生物包裝不需要任何額外的代價(jià)，就可以為這些抗原提供保護(hù)。在有關(guān)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的研究中，從輪狀病毒和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌中所選的抗原分別與霍亂毒素的B和A2亞單位融合，抗原的免疫反應(yīng)顯示出對(duì)Th1的偏愛(ài)性，并可誘導(dǎo)白細(xì)胞介素2和干擾素γ，CD4 + 水平也相應(yīng)增加。Th1的偏愛(ài)性很可能是抗原或者載體的選擇結(jié)果。在佐劑的幫助下，亞單位疫苗的釋放能增加免疫反應(yīng)量。霍亂毒素和大腸桿菌的熱不穩(wěn)定毒素，它們與抗原共表達(dá)，有利于誘導(dǎo)保護(hù)性的免疫產(chǎn)生，改變口服免疫低效率遞呈。另外，有人證實(shí)了轉(zhuǎn)基因植物疫苗的粘膜傳輸中所誘發(fā)的免疫應(yīng)答所具有的黏膜佐劑的特征，這給口服免疫可不需佐劑提供了依據(jù)，同時(shí)也提高了其安全性。
在以植物疫苗的口服免疫研究中，所候選的亞單位疫苗也具有較好的保護(hù)作用。馬鈴薯塊莖或谷物種子中表達(dá)的熱不穩(wěn)定毒素的B 亞基和馬鈴薯中表達(dá)的霍亂毒素B 亞基用于小鼠口服免疫，可以保護(hù)老鼠免受痢疾的感染。另外，口服免疫由谷物種子表達(dá)的傳播性腸炎病毒的S2糖蛋白，對(duì)乳豬能夠起到很好的保護(hù)作用。目前，通過(guò)植物遞送系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)B 型肝炎的疫苗也逐漸成熟。
4.2 提高抗原在植物中的表達(dá)水平
利用植物進(jìn)行疫苗開(kāi)發(fā)，首要的問(wèn)題是，植物能否表達(dá)相關(guān)的蛋白？目前為止，許多亞單位候選抗原在轉(zhuǎn)基因植物中成功表達(dá)，這些抗原主要包括感染人類(lèi)、家畜、野生動(dòng)物的細(xì)菌和病毒抗原。表達(dá)水平很大程度上取決于表達(dá)的蛋白和用于表達(dá)的植物種類(lèi)，同時(shí)，構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)也影響抗原的表達(dá)水平，比如用于表達(dá)的細(xì)胞器基因組(核和質(zhì)粒)、啟動(dòng)子的強(qiáng)度和組織專(zhuān)一性、非翻譯前導(dǎo)序列和信號(hào)序列的選擇和表達(dá)蛋白的靶細(xì)胞器的定位等均對(duì)表達(dá)產(chǎn)生影響。一般而言，利用上述策略可以實(shí)現(xiàn)抗原高水平表達(dá)。然而，很難對(duì)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行比較，因?yàn)樘囟乖瓕?duì)植物表達(dá)系統(tǒng)的選擇很重要，在不同的系統(tǒng)中其表達(dá)效果是不一樣的。近來(lái)，研究人員利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)可提高外源基因的表達(dá)量，Mason等利用一個(gè)核表達(dá)系統(tǒng)，把蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)之后，熱不穩(wěn)定毒素B亞單位在馬玲薯塊莖中表達(dá)量可達(dá)總可溶性蛋白質(zhì)的0.2% ；在谷物種子中的表達(dá)量約占總可溶蛋白的4%或12% ，這些都依賴(lài)于所用的調(diào)節(jié)序列。另外，霍亂毒素（B）亞單位在利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)時(shí)在煙草葉片中的表達(dá)量約占總可溶蛋白的4%。膜蛋白比可溶性蛋白更難于在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)，大量研究表明，膜蛋白在植物中的表達(dá)量遠(yuǎn)不及可溶性蛋白，這就需要優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)以提高表達(dá)水平。
目前，轉(zhuǎn)基因馬玲薯表達(dá)B型肝炎的表面抗原水平已由馬玲薯大約1mg/g增加到馬玲薯大約16mg/g抗原，這樣可以大大減少口服劑量。目前許多研究表明，所欲表達(dá)的抗原在植物中能夠表達(dá)并裝配成四級(jí)結(jié)構(gòu)。糖基化修飾的蛋白也可在植物中進(jìn)行糖基化，盡管糖基化模式很可能存在著差別。在植物系統(tǒng)中表達(dá)的熱不穩(wěn)定蛋白毒素的B亞單位和霍亂毒素的B亞單位，均有GM1受體結(jié)合活性，B型肝炎表面抗原和諾沃克病毒衣殼蛋白可形成類(lèi)病毒顆粒，類(lèi)病毒顆粒的形成，可認(rèn)為有利于誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。
5 植物基因工程疫苗研究進(jìn)展
5.1 反轉(zhuǎn)錄病毒載體
反轉(zhuǎn)錄病毒作為載體是在進(jìn)行動(dòng)物基因工程中發(fā)現(xiàn)的，許多研究人員認(rèn)為它同樣適于植物基因工程，但目前研究的不多。
5.2 單鏈RNA植物病毒
單鏈RNA 植物病毒，即病毒RNA可直接作為mRNA的植物病毒，主要包括苜蓿花葉病毒(ALMV)、豇豆花葉病毒(CPMV)、雀麥花葉病毒(BMV)、煙草花葉病毒(TMV)等。它們作為外源基因載體主要通過(guò)以下步驟感染植物：病毒RNA 首先反轉(zhuǎn)錄為一條單鏈cDNA，在DNA聚合酶作用下形成雙鏈DNA，將其克隆入細(xì)菌質(zhì)粒中，將外源基因插入質(zhì)粒的cDNA中，最后通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄，用帶有外源基因的RNA病毒感染植物，將其轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。
5.3單鏈DNA植物病毒載體
在單鏈DNA 植物病毒載體中，研究最多的是Geminiviruses(簡(jiǎn)稱(chēng)GeNV) ，又叫做雙粒病毒或雙聯(lián)體病毒。它一般含有2個(gè)成對(duì)并存的病毒顆粒，大小約為18～20nm，遺傳物質(zhì)是單鏈DNA ,每2個(gè)顆粒中包含1～2個(gè)、2. 5～3.0 kb的環(huán)狀DNA分子。該病毒寄主廣泛，單子葉植物和雙子葉植物均可被感染，但感染部位僅限于植物的維管組織，且其傳播媒介主要是昆蟲(chóng)，不能通過(guò)機(jī)械接種。
5.4 雙鏈DNA植物病毒載體
雙鏈DNA植物病毒載體中最典型的是花椰菜花葉病毒，它的基因組長(zhǎng)約8kb，主要感染花椰菜、油菜、擬南芥等，主要寄主是蕓苔屬植物，目前尚未發(fā)現(xiàn)可感染豆科和單子葉植物。
6 植物疫苗的安全性
6.1 對(duì)環(huán)境的影響
由于在植物疫苗中包含了病原體的DN段，因而花粉和種子的散播造成的基因逃逸可能給人類(lèi)帶來(lái)新的病原、毒素、過(guò)敏原等，因此對(duì)可能引起的基因漸滲現(xiàn)象必須做出充分的安全性評(píng)價(jià),并規(guī)范植物疫苗的利用和管理，同時(shí)尋求技術(shù)方法。如可恢復(fù)阻塞(RBF)技術(shù)，它能使自然界中因漸滲而攜帶RBF 的雜種或近緣系植物死亡或不育或利用葉綠體轉(zhuǎn)化植物疫苗或培育植物疫苗的雄性不育系，這樣就可避免花粉傳播而帶來(lái)的潛在威脅，轉(zhuǎn)基因植物疫苗有著傳統(tǒng)疫苗無(wú)法比擬的優(yōu)越性，已經(jīng)成為一個(gè)研究熱點(diǎn)了。未來(lái)的研究應(yīng)著眼于生產(chǎn)出作為醫(yī)藥商品的安全、可靠、有效的植物疫苗。轉(zhuǎn)基因植物疫苗應(yīng)用最大的限制就是表達(dá)量低。現(xiàn)在的研究表明：可以通過(guò)葉綠體轉(zhuǎn)化、植物育種和利用食品加工技術(shù)來(lái)提高表達(dá)水平，而且研究還指出，運(yùn)用攜帶蛋白和輔助蛋白可以增加抗原被免疫系統(tǒng)識(shí)別的能力。這些研究都使我們?cè)絹?lái)越接近生產(chǎn)出廉價(jià)“安全口服的商品植物疫苗”，這樣的疫苗將可以幫助人們預(yù)防疾病的傳播。
6.2對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物的影響
抗生素抗性基因是篩選轉(zhuǎn)基因植物常用的標(biāo)記基因。長(zhǎng)期食用這類(lèi)轉(zhuǎn)基因疫苗是否會(huì)對(duì)人體或動(dòng)物造成抗生素醫(yī)療無(wú)效。轉(zhuǎn)基因植物中的新基因會(huì)不會(huì)傳遞給人畜腸道的正常微生物，引起菌群和數(shù)量的變化或插入并表達(dá)，從而危害人畜健康？這些問(wèn)題目前都無(wú)法解答，仍需大量學(xué)者繼續(xù)研究論證。
7 展望
利用植物來(lái)表達(dá)和遞送疫苗技術(shù)的發(fā)展給免疫研究注入了新的內(nèi)容。以往的研究中,在植物中表達(dá)了包括過(guò)濾性病毒、細(xì)菌、腸道和非腸道的病原體等各種不同的抗原，并做了相應(yīng)免疫學(xué)研究。但植物疫苗面臨的最大問(wèn)題是抗原蛋白在植物細(xì)胞表達(dá)量不高，低劑量抗原蛋白往往不能激發(fā)足夠的免疫反應(yīng)，這不能僅靠增加植物組織攝取量得以解決，因?yàn)榈蛣┝康闹貜?fù)免疫可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的免疫耐受，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)此抗原免疫反應(yīng)保持“低調(diào)”，即使以后增加抗原蛋白的劑量也不能改變。另外，機(jī)體每天對(duì)植物組織的攝取量是一定的，不可能無(wú)限增加。因此，未來(lái)研究的重點(diǎn)之一是提高植物疫苗中抗原蛋白的表達(dá)量。隨著生物技術(shù)的發(fā)展和植物基因工程研究的深入，基于植物的疫苗遞送系統(tǒng)將更具吸引力，并呈現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。
參考文獻(xiàn)
1 余祖華，王紅寧.用植物生物反應(yīng)器研制基因工程疫苗的進(jìn)展[J].生
物技術(shù)，2004（8）
摘要：為研究鵝細(xì)小病毒（GPV）VP2蛋白基因工程亞單位疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫效果，本試驗(yàn)對(duì)GPV延邊分離株的vp2基因進(jìn)行原核表達(dá)，將Western-blot試驗(yàn)鑒定為陽(yáng)性的表達(dá)蛋白進(jìn)行乳化，免疫BALB/c小鼠，應(yīng)用ELISA方法監(jiān)測(cè)試驗(yàn)動(dòng)物的體液免疫水平，以此評(píng)價(jià)該疫苗的免疫效果。結(jié)果表明，在三免后2d，重組蛋白佐劑組檢測(cè)到的血清OD450nm值達(dá)0.687，而生理鹽水陰性對(duì)照組為0.038，兩者差異極顯著（P
關(guān)鍵詞：鵝細(xì)小病毒；基因工程亞單位疫苗；免疫試驗(yàn)
關(guān)鍵詞：鵝細(xì)小病毒；基因工程亞單位疫苗；免疫試驗(yàn)
中圖分類(lèi)號(hào)：S835 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-0432（2012）-01-0171-1
中圖分類(lèi)號(hào)：S835 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-0432（2012）-01-0171-1
基金項(xiàng)目：吉林省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（201215230），吉林省牧業(yè)管理局項(xiàng)目(吉牧科字第200902號(hào))。
基金項(xiàng)目：吉林省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（201215230），吉林省牧業(yè)管理局項(xiàng)目(吉牧科字第200902號(hào))。
細(xì)小病毒（Goose Parvovirusis，GP）呈世界性分布，發(fā)病率和病死率均較高，臨床一旦發(fā)病，無(wú)有效的治療辦法，嚴(yán)重危害本地區(qū)養(yǎng)鵝業(yè)的健康發(fā)展[1]。目前，國(guó)內(nèi)外用于GP的預(yù)防主要以傳統(tǒng)疫苗為主，基因工程疫苗尚屬探索階段，尚缺乏GPV基因工程疫苗誘導(dǎo)雛鵝細(xì)胞免疫和體液免疫的系統(tǒng)研究資料。在GPV的三個(gè)結(jié)構(gòu)基因中，Le Gall-Recule等[2]利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，證明表達(dá)的番鴨細(xì)小病毒vp2基因具有抗原性和免疫原性。本研究擬對(duì)GPV的vp2基因進(jìn)行原核表達(dá)，制備基因工程亞單位疫苗，并進(jìn)行免疫試驗(yàn)分析，為GPV的vp2基因工程疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。
細(xì)小病毒（Goose Parvovirusis，GP）呈世界性分布，發(fā)病率和病死率均較高，臨床一旦發(fā)病，無(wú)有效的治療辦法，嚴(yán)重危害本地區(qū)養(yǎng)鵝業(yè)的健康發(fā)展[1]。目前，國(guó)內(nèi)外用于GP的預(yù)防主要以傳統(tǒng)疫苗為主，基因工程疫苗尚屬探索階段，尚缺乏GPV基因工程疫苗誘導(dǎo)雛鵝細(xì)胞免疫和體液免疫的系統(tǒng)研究資料。在GPV的三個(gè)結(jié)構(gòu)基因中，Le Gall-Recule等[2]利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，證明表達(dá)的番鴨細(xì)小病毒vp2基因具有抗原性和免疫原性。本研究擬對(duì)GPV的vp2基因進(jìn)行原核表達(dá)，制備基因工程亞單位疫苗，并進(jìn)行免疫試驗(yàn)分析，為GPV的vp2基因工程疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1 材料與方法
1.1 材料
1.1 材料
BALB/c小鼠購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所；弗氏佐劑購(gòu)自sigma公司；其他載體與試劑由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供。
BALB/c小鼠購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所；弗氏佐劑購(gòu)自sigma公司；其他載體與試劑由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供。
1.2 GPV延邊株vp2基因工程亞單位疫苗的制備
1.2 GPV延邊株vp2基因工程亞單位疫苗的制備
采用常規(guī)方法提取GPV延邊株的基因組DNA，以特異引物[3]擴(kuò)增vp2基因片段，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET30a-vp2，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，將Western-blot鑒定為陽(yáng)性的蛋白進(jìn)行親和層析純化，純化后重組蛋白與弗氏佐劑混合乳化，制備GPV的基因工程亞單位疫苗。
采用常規(guī)方法提取GPV延邊株的基因組DNA，以特異引物[3]擴(kuò)增vp2基因片段，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET30a-vp2，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，將Western-blot鑒定為陽(yáng)性的蛋白進(jìn)行親和層析純化，純化后重組蛋白與弗氏佐劑混合乳化，制備GPV的基因工程亞單位疫苗。
1.3 vp2基因工程亞單位疫苗的動(dòng)物免疫試驗(yàn)
1.3 vp2基因工程亞單位疫苗的動(dòng)物免疫試驗(yàn)
免疫試驗(yàn)共分3組，每組10只BALB/c小鼠，分別為接種VP2重組蛋白組，VP2重組蛋白加佐劑組和生理鹽水對(duì)照組。在每一次免疫前采血分離血清，第3次免疫后的第2d、4d、6d分別采血分離血清，均存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>
免疫試驗(yàn)共分3組，每組10只BALB/c小鼠，分別為接種VP2重組蛋白組，VP2重組蛋白加佐劑組和生理鹽水對(duì)照組。在每一次免疫前采血分離血清，第3次免疫后的第2d、4d、6d分別采血分離血清，均存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>
1.4 ELISA監(jiān)測(cè)血清VP2抗體水平
1.4 ELISA監(jiān)測(cè)血清VP2抗體水平
用純化的VP2重組蛋白為抗原包被反應(yīng)孔，以小鼠抗GPV陽(yáng)性血清為一抗，以山羊抗小鼠HRP-IgG為二抗，進(jìn)行ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠血清中抗體水平，并分析vp2基因工程亞單位疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的體液免疫水平。采用SAS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。-IgG為二抗，進(jìn)行ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠血清中抗體水平，并分析vp2基因工程亞單位疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的體液免疫水平。采用SAS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
2 結(jié)果
2 結(jié)果
2.1 GPV vp2基因的原達(dá)表達(dá)
2.1 GPV vp2基因的原達(dá)表達(dá)
對(duì)pET30a-vp2進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE與Western-blot試驗(yàn)表明，在經(jīng)考馬斯亮蘭染色的SDS-PAGE膠上和NC膜上均出現(xiàn)VP2特異性條帶（圖略），百未誘導(dǎo)的重組菌未出現(xiàn)特異條帶。
對(duì)pET30a-vp2進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE與Western-blot試驗(yàn)表明，在經(jīng)考馬斯亮蘭染色的SDS-PAGE膠上和NC膜上均出現(xiàn)VP2特異性條帶（圖略），百未誘導(dǎo)的重組菌未出現(xiàn)特異條帶。
2.2 GPV重組VP2蛋白的體液免疫水平
2.2 GPV重組VP2蛋白的體液免疫水平
對(duì)采集的BALB/c免疫小鼠血清進(jìn)行ELISA試驗(yàn)檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)三次，取平均值計(jì)算，詳見(jiàn)表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，在三免后第2d，重組蛋白組和重組蛋白佐劑組免疫小鼠血清的OD450nm值均達(dá)到最高值，重組蛋白佐劑組與生理鹽水陰性對(duì)照組間差異極顯著（P
對(duì)采集的BALB/c免疫小鼠血清進(jìn)行ELISA試驗(yàn)檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)三次，取平均值計(jì)算，詳見(jiàn)表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，在三免后第2d，重組蛋白組和重組蛋白佐劑組免疫小鼠血清的OD450nm值均達(dá)到最高值，重組蛋白佐劑組與生理鹽水陰性對(duì)照組間差異極顯著（P
表1 免疫后BALB/c免疫小鼠血清中抗體消長(zhǎng)變化（OD450）
表1 免疫后BALB/c免疫小鼠血清中抗體消長(zhǎng)變化（OD450）
組別 一免前 二免前 三免前 三免后2d 三免后4d 三免后6d
組別 一免前 二免前 三免前 三免后2d 三免后4d 三免后6d
重組蛋白組 0.039±
重組蛋白組 0.039±
0.015 0.312±0.012 0.434±0.022 0.536±0.031 0.480±0.036 0.245±
0.015 0.312±0.012 0.434±0.022 0.536±0.031 0.480±0.036 0.245±
0.017
0.017
重組蛋白佐劑組 0.033±
重組蛋白佐劑組 0.033±
0.032 0.498±0.017 0.663±0.028 0.687±0.036 0.569±0.037 0.461±
0.032 0.498±0.017 0.663±0.028 0.687±0.036 0.569±0.037 0.461±
0.019
0.019
生理鹽水組 0.037±
生理鹽水組 0.037±
0.013 0.031±0.015 0.039±0.015 0.038±0.015 0.034±0.015 0.030±
0.013 0.031±0.015 0.039±0.015 0.038±0.015 0.034±0.015 0.030±
0.015
0.015
3 討論
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本研究以GPV的vp2基因?yàn)槟康幕?，以pET30a為表達(dá)載體，在體外高效表達(dá)了VP2蛋白，經(jīng)重組蛋白免疫小鼠試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該重組蛋白具有免疫活性，重組蛋白佐劑組與陰性組間血清抗體水平差異極顯著，說(shuō)明vp2基因可以作為基因工程疫苗的候選基因，而重組蛋白佐劑組與重組蛋白組間血清抗體水平差異顯著，提示佐劑對(duì)基因工程亞單位苗的免疫效果影響較大。由于本研究只是初步的預(yù)試驗(yàn)，未進(jìn)行攻毒試驗(yàn)和鵝體內(nèi)試驗(yàn)，這將在下一步試驗(yàn)中予以開(kāi)展。本研究結(jié)果為GPV vp2基因工程疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。
本研究以GPV的vp2基因?yàn)槟康幕?，以pET30a為表達(dá)載體，在體外高效表達(dá)了VP2蛋白，經(jīng)重組蛋白免疫小鼠試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該重組蛋白具有免疫活性，重組蛋白佐劑組與陰性組間血清抗體水平差異極顯著，說(shuō)明vp2基因可以作為基因工程疫苗的候選基因，而重組蛋白佐劑組與重組蛋白組間血清抗體水平差異顯著，提示佐劑對(duì)基因工程亞單位苗的免疫效果影響較大。由于本研究只是初步的預(yù)試驗(yàn)，未進(jìn)行攻毒試驗(yàn)和鵝體內(nèi)試驗(yàn)，這將在下一步試驗(yàn)中予以開(kāi)展。本研究結(jié)果為GPV vp2基因工程疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)
參考文獻(xiàn)
[1] 方定一.小鵝瘟的介紹[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,1962,8:19-20．
[1] 方定一.小鵝瘟的介紹[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,1962,8:19-20．
[2] le Gall-Recule, Jestin V,Chagnaud P.Expression of muscovy duck parvovirus capsid proteins (VP2 and VP3) in a baculovirus expression system and demonstration of immunity induced by the recombinant proteins [J].J GenVirol,1996,77(9):2159-2163.
[2] le Gall-Recule, Jestin V,Chagnaud P.Expression of muscovy duck parvovirus capsid proteins (VP2 and VP3) in a baculovirus expression system and demonstration of immunity induced by the recombinant proteins [J].J GenVirol,1996,77(9):2159-2163.
[3] 胡曉靜,潘杰,陳進(jìn)喜,等.2株鵝細(xì)小病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白vp2基因的克隆和序列分析[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2008,(23):262-265.
[3] 胡曉靜,潘杰,陳進(jìn)喜,等.2株鵝細(xì)小病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白vp2基因的克隆和序列分析[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2008,(23):262-265.
作者簡(jiǎn)介：高旭(1977-)，男，吉林德惠人，博士，副教授，研究方向：動(dòng)物病毒病分子生物學(xué)與免疫學(xué)。
2014年2月7日，上海市新發(fā)與再現(xiàn)傳染病研究所消息稱(chēng)，H7N9禽流感基因疫苗已在上海初步完成研發(fā)，目前進(jìn)入臨床試驗(yàn)申報(bào)階段。
研究人員透露，疫苗的有效性和安全性還要進(jìn)一步通過(guò)臨床評(píng)價(jià)來(lái)驗(yàn)證。待三期臨床完成后，才有可能進(jìn)入市場(chǎng)，至少需要6年時(shí)間，過(guò)程中仍存在一定風(fēng)險(xiǎn)。
康恩貝抗抑郁新藥獲批生產(chǎn)
據(jù)國(guó)家食藥監(jiān)局網(wǎng)站最新信息，康恩貝3.1類(lèi)新藥草酸艾司西酞普蘭片已獲批生產(chǎn)。該藥是目前全球廣為應(yīng)用的抗抑郁一線藥物，2013年國(guó)內(nèi)銷(xiāo)售總額超過(guò)1億元。
康恩貝此次精神類(lèi)新藥獲批生產(chǎn)，可豐富公司的現(xiàn)有產(chǎn)品線，對(duì)未來(lái)業(yè)績(jī)產(chǎn)生積極作用。
俄羅斯研發(fā)出世界首個(gè)戒煙疫苗
日前，俄羅斯希姆基納米實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家研究出世界第一種戒煙接種疫苗。接種這種疫苗可讓煙民永遠(yuǎn)戒煙， 因?yàn)槭芊N者機(jī)體會(huì)產(chǎn)生一種阻止尼古丁進(jìn)入大腦的特殊抗體，這種抗體可以讓煙民不想吸煙。
目前，這種疫苗已成功通過(guò)第一階段試驗(yàn)，進(jìn)入臨床階段。
Devices器械
中國(guó)電信推出全球首款醫(yī)療診斷手機(jī)
近日，中國(guó)電信與瑞士企業(yè)LifeWatch聯(lián)合推出全球首款醫(yī)療診斷手機(jī)LifeWatchV，由中國(guó)云狐科技提供其移動(dòng)醫(yī)療系統(tǒng)平臺(tái)。
該產(chǎn)品是一款搭載安卓系統(tǒng)的智能手機(jī)，內(nèi)置7種不同的健康測(cè)試。用戶(hù)只需將拇指放在屏幕感應(yīng)器上，手機(jī)就能開(kāi)始身體檢測(cè)，包括心電圖、血糖、血氧以及心率等。
可監(jiān)測(cè)血糖值隱形眼鏡問(wèn)世
據(jù)谷歌公司官方消息，其目前正在測(cè)試一款具有高科技含量的隱形眼鏡，可以在佩戴后針對(duì)糖尿病患者眼淚中所含的糖分進(jìn)行監(jiān)測(cè)，隨時(shí)讓患者掌握自己的血糖水平。
這款智能隱形眼鏡內(nèi)置了微型無(wú)線芯片和小型葡萄糖傳感器，目前處于臨床研發(fā)過(guò)程中，將來(lái)有望幫助糖尿病患者真正走出24小時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血糖的痛苦。
可檢測(cè)肝癌化療效果的超聲系統(tǒng)問(wèn)世
近日，日本兵庫(kù)醫(yī)科大學(xué)超聲波中心和東芝醫(yī)療的研究人員開(kāi)發(fā)出一種可用于快速檢測(cè)肝癌患者化療效果的新型超聲檢測(cè)系統(tǒng)。
研究人員介紹，這套新型超聲檢測(cè)系統(tǒng)能夠自動(dòng)追蹤病灶位置，檢測(cè)起來(lái)比較簡(jiǎn)便。其檢測(cè)方法是，在肝癌患者接受化療一到兩周后，醫(yī)務(wù)人員將造影劑注射到患者血液中，然后采用超聲檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行觀察。造影劑流入腫瘤用時(shí)越長(zhǎng)，說(shuō)明化療藥物的效果越好，腫瘤正在縮小。
Technology技術(shù)
中國(guó)發(fā)現(xiàn)白血病抑癌新基因
中國(guó)科學(xué)家近期的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)在急性白血病患者中有較常見(jiàn)突變的抑癌基因，且揭示了其功能異常與多種不同致癌基因之間的協(xié)同作用。
研究人員通過(guò)對(duì)一個(gè)混合譜系白血?。∕LL）患者及其正常同卵雙胞胎的血細(xì)胞進(jìn)行全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了罕見(jiàn)的功能性MLL-NRIP3致癌基因和H3K36三甲基化的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETD2的遺傳突變。此項(xiàng)發(fā)現(xiàn)將促進(jìn)對(duì)白血病乃至其他癌癥發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，有助于臨床藥物開(kāi)發(fā)。
中國(guó)經(jīng)性感染艾滋病毒者發(fā)病更快
北京協(xié)和醫(yī)院感染內(nèi)科李太生教授等人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)6年的研究證實(shí)，中國(guó)經(jīng)性傳播途徑感染艾滋病病毒者，在未經(jīng)干預(yù)情況下往往四五年發(fā)病，而非此前歐美研究者認(rèn)為的平均需8年。
中國(guó)經(jīng)性途徑感染艾滋病病毒者中，病毒亞型多為CRF01_AE，該亞型在感染其靶細(xì)胞時(shí)，須要借助“二傳手”，且選用輔助受體CXCR4當(dāng)“二傳手”的比例要顯著高于其他亞型。CXCR4可能正是這些艾滋病病毒感染者更快發(fā)病的原因。
中國(guó)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化研究獲新突破
滅活疫苗與活疫苗
菌苗和疫苗都是由微生物制成的生物制劑，接種于人體后，可誘生特異性免疫。我國(guó)習(xí)慣上把細(xì)菌、螺旋體生物制劑稱(chēng)為菌苗，把病毒、立克次體、衣原體等的生物制劑稱(chēng)為疫苗。
通常所用的疫(菌)苗有兩類(lèi)：一是滅活疫(菌)苗，即把微生物培養(yǎng)物用物理或化學(xué)方法殺死而制成。二是減毒活疫(菌)苗，即將有毒力的微生物用人工定向變異的方法使其毒力減弱，或從自然界篩選出來(lái)的弱毒或無(wú)毒微生物制成活疫(菌)苗。
滅活疫(菌)苗的優(yōu)點(diǎn)是：在使用上可單獨(dú)注射，也可幾種疫苗按一定比例混合注射，較易保存。保存期限為1年，注射后較安全。缺點(diǎn)是：注射次數(shù)多，初種至少需接種2次以上，注射劑量較大?？赡艹霈F(xiàn)發(fā)熱、全身或局部反應(yīng)，其免疫效果也較差，不持久，常需數(shù)月或每年增強(qiáng)免疫一次。
活疫(菌)苗的優(yōu)點(diǎn)是：其免疫作用較強(qiáng)，一般只需接種1次。接種劑量也較小，接種后反應(yīng)小或無(wú)，接種后的免疫效果可靠而持久，一般可維持1～5年。缺點(diǎn)是：一般只宜單獨(dú)使用；疫苗不易保存，在普通冰箱內(nèi)兩周即失效。
要特別注意制備活疫苗的病原減毒株的穩(wěn)定性以及致癌等問(wèn)題。因此，研制新發(fā)病原的疫苗時(shí)，由于對(duì)該病原的特殊性尚未完全了解，應(yīng)先從制備滅活疫苗開(kāi)始。
基因工程疫苗
基因工程是按照人類(lèi)的愿望，通過(guò)基因重新組合得到新的生物品種的一種技術(shù)。這種基因工程方法制備生產(chǎn)的疫苗稱(chēng)為基因工程疫苗。以乙肝疫苗為例，就是用基因剪切技術(shù)將調(diào)控乙肝表面抗原(HB―sAg)的這段基因剪切下來(lái)，裝到一個(gè)表達(dá)載體中，表達(dá)載體可以把這段基因的功能發(fā)揮出來(lái)；再把這種表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)，如大腸桿菌或酵母菌等，最后再通過(guò)這些大腸桿菌或酵母菌的快速繁殖，產(chǎn)生出大量我們所需的乙肝疫苗。
過(guò)去，乙肝疫苗的來(lái)源，是以乙肝病毒攜帶者的血液為原料，把HB－sAg提取出來(lái)制成的，制造過(guò)程復(fù)雜，價(jià)格也較貴。而且這種血源性疫苗也不夠安全，它可能混有其他病毒的污染。同時(shí)，血液來(lái)源也是極有限的，遠(yuǎn)不能滿足全國(guó)的需要?；蚬こ桃呙绲膯?wèn)世解決了這一難題。
基因工程在醫(yī)學(xué)上已得到廣泛應(yīng)用，并且應(yīng)用領(lǐng)域不斷被拓寬，取得了令人驚喜的成就。
1 基因工程制藥
基因工程制藥開(kāi)創(chuàng)了制藥工業(yè)的新紀(jì)元，解決了過(guò)去不能生產(chǎn)或者不能經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)的藥物問(wèn)題?，F(xiàn)在，人類(lèi)已經(jīng)可以按照需要，通過(guò)基因工程生產(chǎn)出大量廉價(jià)優(yōu)質(zhì)的新藥物和診斷試劑，諸如人生長(zhǎng)激素、人的胰島素、尿激酶、紅細(xì)胞生成素、白細(xì)胞介素、干擾素、細(xì)胞集落刺激因子、表皮生長(zhǎng)因子等。令人振奮的是，具有高度特異性和針對(duì)性的基因工程蛋白質(zhì)多肽藥物的問(wèn)世，不僅改變了制藥工業(yè)的產(chǎn)品結(jié)構(gòu)，而且為治療各種疾病如糖尿病、腎衰竭、腫瘤、侏儒癥等提供了有效的藥物。眾所周知，醫(yī)治侏儒癥的良藥是人生長(zhǎng)激素，倘若從人的尸體中獲取，治療一個(gè)病人就需要600具尸體的腦下垂體才能獲得足夠的量；倘若運(yùn)用基因工程生產(chǎn)，就可從每升基因工程菌液中得到2．4g。人們?yōu)榇硕铺祗@的興奮!成本如此之低，又如此之高產(chǎn)，其巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，由此可見(jiàn)。
2 基因工程抗病毒疫苗
為人類(lèi)抵御病毒侵襲提供了用武之地。基因工程乙型肝炎疫苗、狂犬病疫苗、流行性出血熱病毒疫苗、輪狀病毒疫苗等應(yīng)用于臨床，提高了人類(lèi)對(duì)各種病毒病的抵御能力。比如，乙型肝炎病毒疫苗的問(wèn)世，使我國(guó)新生兒不再遭遇乙型肝炎病毒的侵襲，也降低了人群肝癌的發(fā)病率。又如，為治愈癌癥正在研制的用單克隆抗體制成的“生物導(dǎo)彈”，就是按照人類(lèi)的設(shè)計(jì)，把“生物導(dǎo)彈”發(fā)射出去，精確地命中癌細(xì)胞，并炸死癌細(xì)胞而不傷害健康的細(xì)胞。就單克隆細(xì)胞而言，單克隆細(xì)胞在腫癌的診斷檢測(cè)、顯示定位、監(jiān)測(cè)病變、監(jiān)測(cè)療效等方面也有重要價(jià)值。人類(lèi)還通過(guò)基因工程生產(chǎn)抵御各種病菌、血吸蟲(chóng)、虐原蟲(chóng)等疫苗，提高人體對(duì)各種傳染病的免疫力。脫氧核糖核酸或者基因疫苗的問(wèn)世，變革了機(jī)體的免疫方式。如今，人們翹首關(guān)注困擾人類(lèi)的艾滋病病毒(人類(lèi)免疫缺陷病毒)疫苗的早日問(wèn)世?；蚬こ炭贵w技術(shù)的發(fā)展，為克服單克隆抗體生產(chǎn)細(xì)胞株在生產(chǎn)過(guò)程中的不穩(wěn)定性，為生產(chǎn)大量高效抗病毒疫苗提供了先進(jìn)的生產(chǎn)工藝。
3 基因工程治療疾病
臨床實(shí)踐已經(jīng)表明，基因治病已經(jīng)變革了整個(gè)醫(yī)學(xué)的預(yù)防和治療領(lǐng)域。比如，不治之癥——白癡病，用健康的基因更換或者矯正患者的有缺損的基因，就有可能根治這種疾病?，F(xiàn)在已知的人類(lèi)遺傳疾病約有4000種，包括單基因缺陷和多基因綜合征。運(yùn)用基因工程技術(shù)或者基因打靶的手段，將病毒的基因殺滅，插入校正基因，得以治療、校正和預(yù)防遺傳疾病的目的。人類(lèi)精心設(shè)計(jì)的基因工程操作，克服了不同個(gè)體甚至物種之間由于器官移植所產(chǎn)生的免疫排斥作用，實(shí)現(xiàn)人體之間的移植已獲成功，成功的實(shí)體器官移植有腎、心、肝、胰、肺、腸，也有雙器官和多器官的聯(lián)合移植。而人體與動(dòng)物之間的器官移植成為現(xiàn)實(shí)，臨床應(yīng)用已是指日可待的事了。脫氧核糖核酸化學(xué)合成的完善和自動(dòng)化，脫氧核糖核酸擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)化，為合成基因“探針”，提高臨床診斷的質(zhì)量，是人類(lèi)所殷切企盼的?；蛑委熡袃煞N途徑，一是體細(xì)胞的基因治療，二是生殖細(xì)胞的基因治療。體細(xì)胞的基因治療是將正常的遺傳基因?qū)胧芫穆鸭?xì)胞內(nèi)，讓這種遺傳物質(zhì)進(jìn)入受精卵的基因組內(nèi)，并隨著受精卵分裂，分配到每一個(gè)子細(xì)胞中去，最終糾正未來(lái)個(gè)體的遺傳缺陷。而生殖細(xì)胞的基因治療是將人類(lèi)設(shè)計(jì)的“目的基因”導(dǎo)入患有遺傳病病人的生殖細(xì)胞內(nèi)，此法操作技術(shù)異常復(fù)雜，又涉及倫理，緩行之理充足，故尚無(wú)人涉足。
4 基因工程診病
