摘要：人工核酸內(nèi)切酶技術(shù)CRISPR（Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats）/Cas9是當(dāng)前最有效的基因編輯工具。外膜囊泡（Outer membrane vesicles, OMVs）是細菌主動分泌和吸收的雙層膜結(jié)構(gòu)，具有運載DNA、蛋白等多種物質(zhì)的能力。為探究以O(shè)MVs為CRISPR編輯工具的轉(zhuǎn)運載體、用于病原菌清除的可行性，本研究以高致病性無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae or Group B Streptococcus，GBS）為材料，在原有CRISRR質(zhì)粒pCas9的基礎(chǔ)上，通過分子克隆，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pCas9-2.0和具有靶向剪切無乳鏈球菌cfb基因的毒性質(zhì)粒pCas9-cfb，將質(zhì)粒pCas9-cfb轉(zhuǎn)入asd缺陷型大腸桿菌X6097后，一方面進行重組菌的OMVs制備、電鏡觀察和DNA分析，另一方面與GBS混合培養(yǎng)，最后在選擇平板上對GBS菌落計數(shù)。結(jié)果顯示，重組了質(zhì)粒pCas9-cfb的X6097能夠分泌OMVs且內(nèi)含質(zhì)粒；實驗組平板上沒有GBS菌落產(chǎn)生；對照組平板上菌落經(jīng)鑒定皆為含pCas9-2.0的GBS，且菌落數(shù)量隨共培養(yǎng)時間的延長和卡那霉素（Kan）的濃度升高而增多。綜上可見，OMVs可以運載CRISPR為染色體剪切工具、并實現(xiàn)對靶向病原菌的定向清除，但受OMVs分泌量的限制消除效率較低。同傳統(tǒng)的預(yù)防性疫苗相比，本研究為病原菌清除提供了一個新的研究方向；同當(dāng)前以噬菌體為載體的研究思路相比，本方法更簡便、成本更低。另外，本研究也為難以進行電擊轉(zhuǎn)化的菌株提供了一個更簡單的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法。