摘要：目的原核表達弓形蟲TgPRF蛋白,制備多克隆抗體并評價其作為內(nèi)參抗體的可行性。方法以剛地弓形蟲RH株速殖子cDNA為模板,PCR擴增TgPRF編碼基因,克隆至pGEX-4T-1載體,轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21。經(jīng)IPTG誘導表達后,SDS-PAGE分析重組蛋白表達情況。利用GST標簽親和層析法純化重組蛋白。以純化后蛋白為抗原免疫新西蘭大白兔,制備抗TgPRF多克隆抗體。收集弓形蟲RH株速殖子,以制備的多克隆抗體為一抗,Western blotting檢測抗體特異性及效價。收集ATc調(diào)控下不同時間點的弓形蟲iKO-Ty-TgAPH蟲株速殖子進行Western blotting,以抗Ty和抗TgPRF抗體為一抗,檢測TgAPH和TgPRF表達量的變化。結(jié)果 SDS-PAGE顯示:TgPRF在誘導4 h后表達量趨于飽和,相對分子量為52 ku,且呈可溶性表達。弓形蟲RH株速殖子總蛋白進行的Western blotting顯示:抗TgPRF多克隆抗體可識別內(nèi)源性的TgPRF,且該多克隆抗體稀釋至1∶10 000時仍可見明顯條帶;iKO-Ty-TgAPH蟲株速殖子總蛋白進行的Western blotting顯示:TgAPH的表達量隨ATc作用時間的增加呈遞減趨勢,而TgPRF表達量基本維持恒定。結(jié)論本實驗制備的抗TgPRF多克隆抗體特異性和效價良好,可作為衡量弓形蟲特定蛋白表達量的內(nèi)參抗體,也可直接檢測內(nèi)源性TgPRF的表達。